kisspeptinje peptid s malou molekulou složený z 54 aminokyselinových zbytků s molekulovou hmotností přibližně 6000 Daltonů. Jeho aminokyselinová sekvence je u savců vysoce konzervovaná, což znamená, že má podobnou strukturu u různých druhů. U lidí je aminokyselinová sekvence kisspeptinu H-Phe Gly Gly Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Eu Ser Arg Al Glu Eu Ser Arg. Tento gen, kódovaný genem Kiss1, je nejprve transkribován do prekurzoru proteinu Kiss1, který prochází řadou zpracování a sestřihu, aby se nakonec vytvořil zralý kisspeptin. Degradace kisspeptinu se provádí především prostřednictvím peptidáz, které jej rozkládají na menší fragmenty nebo jednotlivé aminokyseliny. Hraje klíčovou roli v reprodukčním systému. Je považován za důležitý faktor uvolňující hormon uvolňující gonadotropin (GnRH), který může stimulovat uvolňování gonadotropinů, a tím podporovat zrání a ovulaci zárodečných buněk. Kromě toho se kisspeptin také podílí na regulaci dalších fyziologických procesů, jako jsou emoce, paměť a kognitivní funkce.
Kisspeptinový peptid, také známý jako Kiss1 peptid nebo RFRP-1 peptid, je neuropeptid nacházející se v lidském těle. V laboratoři se k syntéze kisspeptinu běžně používají následující metody syntézy:
Chemická syntéza:
Chemická syntéza je nejběžněji používanou metodou pro syntézu kisspeptinu v laboratoři. Tato metoda zahrnuje více chemických reakcí, jako je kondenzace, deprotekce a odsolování. Mezi nimi je klíčovým krokem tvorba peptidových vazeb mezi aminokyselinami, obvykle pomocí klasických vazebných činidel, jako je EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) - karbodiimid) nebo BOP ( benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát). Výhodou chemické syntézy je, že lze získat vysoce čistý kisspeptin, ale nevýhodou této metody je, že vyžaduje těžkopádné experimentální kroky a přísné laboratorní podmínky, přičemž výtěžek je nízký.
Konkrétní reakční kroky jsou následující:
1. Připravte si výchozí materiály. To zahrnuje požadované aminokyseliny, aktivátory (jako je EDC nebo BOP), deprotekční činidla (jako je kyselina trifluoroctová nebo kyselina bromovodíková), stejně jako další nezbytná činidla a roztoky pufrů.
2. Za bezvodých podmínek a bez kyslíku rozpusťte požadované aminokyseliny ve vhodných rozpouštědlech, jako je dimethylformamid (DMF) nebo N,N-dimethylacetamid (DMA).
3. Přidejte požadovaný aktivátor (např. EDC nebo BOP) a míchejte při pokojové teplotě po určitou dobu, aby se vytvořily peptidové vazby.
4. Přidejte deprotektivní činidla (jako je kyselina trifluoroctová nebo kyselina bromovodíková) k vytvořeným peptidovým vazbám, aby se odstranily skupiny chránící aminoskupinu.
5. Přidejte požadované ochranné skupiny (jako je Boc nebo Fmoc) pro ochranu nově vytvořených aminoskupin.
6. Opakujte výše uvedené kroky, dokud nebudou připojeny všechny požadované aminokyseliny.
7. Přidejte požadované modifikace postranního řetězce a/nebo markery k peptidovému řetězci.
8. Nakonec byla provedena deprotekční reakce, aby se odstranily všechny ochranné skupiny a získal se purifikovaný kisspeptin.
Výše uvedené je základní metoda chemické syntézy a konkrétní kroky se mohou lišit v závislosti na specifické sekvenci kisspeptinu a požadovaných modifikacích. Během celého procesu syntézy je nutné přísně kontrolovat experimentální podmínky, včetně rozpouštědla, teploty, pH, času a tlaku, aby byl zajištěn hladký průběh reakce a vysoká čistota produktu. Zároveň je nutné dbát na bezpečnost chemických reakcí a vyvarovat se používání nebezpečných činidel a operací.
Syntéza genetického inženýrství:
Syntéza genetického inženýrství je účinná, rychlá a ekonomická metoda pro syntézu kisspeptinu. Tato metoda využívá technologii genetického inženýrství k expresi prekurzorového proteinu kisspeptinu v mikroorganismech, jako je Escherichia coli nebo kvasinky, a poté prochází následným zpracováním za účelem získání zralého kisspeptinu.
Následuje zjednodušený proces:
1. Klonování genu: Nejprve je nutné získat genovou sekvenci kisspeptinu. To lze získat z biologických tkání pomocí RT PCR, sekvenování genomu nebo jiných technik klonování genů.
2. Výběr vektoru: Dále musíte vybrat vektor pro umístění genové sekvence kisspeptinu. Obvykle se jedná o neškodný bakteriální plazmid nebo virový vektor. Vektor je navržen tak, aby vložil gen kisspeptin a vnesl jej do buňky.
3. Transformace genu: Vložte gen kisspeptinu do vektoru a poté přeneste tento komplex (gen+vektor) do inženýrských bakterií, jako je Escherichia coli nebo kvasinky.
4. Exprese: U inženýrských bakterií je gen kisspeptin „čten“ a řídí syntézu proteinů. Tyto proteiny jsou obvykle připojeny ke speciálním chemickým značkám pro následné procesy čištění.
5. Následné zpracování: Tyto prekurzorové proteiny kisspeptinu produkované upravenými bakteriemi lze shromáždit a purifikovat pomocí kroků, jako je fragmentace buněk, centrifugace a dialýza.
Výhodou této metody je, že může produkovat velké množství kisspeptinu v krátkém časovém období a cena je relativně nízká. Navíc díky použití mikroorganismů má tento způsob výroby minimální dopad na životní prostředí. Nevýhodou této metody však je, že vyžaduje manipulaci s mikroorganismy, a proto vyžaduje určité laboratorní vybavení a dovednosti.
Bioenzymatická hydrolýza:
Bioenzymatická hydrolýza je metoda syntézy kisspeptinu pomocí enzymové katalýzy. Tato metoda využívá specifické biologické enzymy k přeměně prekurzorových proteinů kisspeptinu na zralý kisspeptin.
Základní kroky pro syntézu kisspeptinu pomocí biologické enzymatické hydrolýzy:
1. Klonování genu a výběr vektoru: Nejprve je ještě nutné získat genovou sekvenci kisspeptinu a poté vybrat vektor pro její vložení.
2. Exprese: Vložte gen kisspeptinu do vektoru a poté přeneste tento komplex (gen+vektor) do inženýrské bakterie.
3. Syntéza proteinů: V inženýrských bakteriích je gen kisspeptin „čten“ a řídí syntézu proteinů. Tyto proteiny jsou obvykle připojeny ke speciálním chemickým značkám.
4. Bioenzymatická hydrolýza: Použití specifických proteáz, jako je subtilisin nebo trypsin, k přeměně prekurzorových proteinů na zralý kisspeptin. Biologické enzymy mají vysokou specificitu a katalytickou účinnost, takže tento krok reakce lze dokončit rychle a efektivně.
5. Následné zpracování: Prostřednictvím řady kroků, jako je fragmentace buněk, centrifugace, dialýza atd., se kisspeptin nakonec shromáždí a přečistí.
Výhodou této metody je, že dokáže dokončit syntézu kisspeptinu v krátkém čase. Nejen, že je rychlost syntézy rychlá, ale také katalytická účinnost biologických enzymů je extrémně vysoká, což může výrazně zlepšit výtěžek cílových proteinů. Mezitím biologické enzymy používané při enzymatické hydrolýze mají často vysokou specifitu a mohou přesně a efektivně fungovat v komplexních biologických molekulách. Proto je tato metoda šetrná k životnímu prostředí a má malý dopad na strukturu a funkci cílového proteinu. Tento způsob má však také určitá omezení, jako jsou obtíže při získávání a přípravě biologických enzymů, vysoké náklady a potřeba přesné kontroly reakčních podmínek.
Buněčná kultura:
Buněčná kultura je metoda syntetizující kisspeptin v laboratoři. Tento způsob zahrnuje kultivaci buněčné linie obsahující sekvenci genu kisspeptinu a poté sbírání secernovaného kisspeptinu z kultivačního média. Konkrétně se genová sekvence kisspeptinu nejprve vloží do buněčné linie, následuje buněčná kultura a optimalizace stavu. Nakonec je z kultivačního média odebrán kisspeptin. Výhodou buněčné kultury je, že dokáže produkovat velké množství kisspeptinu a provoz této metody je poměrně jednoduchý.
Stručně řečeno, existují různé metody pro syntézu kisspeptinu v laboratoři a každá metoda má své vlastní výhody a nevýhody. Pro syntézu lze vybrat vhodné metody podle aktuální potřeby. Mezi nejběžněji používanými metodami jsou chemická syntéza a syntéza genetického inženýrství, zatímco enzymatická hydrolýza a buněčná kultura jsou další proveditelné možnosti.