Aprotinin CAS 9087-70-1

Aprotinin78R2S7, molekulární vzorec C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Je to inhibitor proteázy, který může inhibovat trypsin a chymotrypsin, zabránit aktivaci dalších aktivních proteazomů ve slinivce a samoaktivaci trypsinogenu. Klinicky se používá k prevenci a léčbě akutní pankreatitidy, krvácení způsobeného fibrinolýzou a diseminované intravaskulární koagulace. Může být také použit pro protišokovou léčbu. Inhibitory proteáz jsou látky, které se mohou vázat na enzymy a snižovat rychlost degradace substrátu. Inhibitory proteázy s proteinovými vlastnostmi jsou široce přítomny a ze sójových bobů byly izolovány dva typy inhibitorů proteázy s proteinovými vlastnostmi: Kuniz trypsinový inhibitor a Baumann Bellckův inhibitor. První má molekulovou hmotnost 20-25 ku, zatímco druhý má molekulovou hmotnost 8 ku.

Rekombinantníaprotinin(RTI16) může inhibovat kininázu a trypsin a je přirozeným ne-specifickým inhibitorem serinové proteázy. Je to jednořetězcový základní protein složený z 58 aminokyselinových zbytků, se 3 disulfidovými vazbami propojenými v řetězci-. Již dlouhou dobu se aprotinn používá k léčbě akutní pankreatitidy. Po 90. letech 20. století se rekombinantní aprotinn začal používat v kardiotorakální chirurgii k ochraně krevních destiček, snížení krvácení a exsudace a ke klinické léčbě pacientů s poruchami koagulace. Proto se velikost trhu aprotinnu rychle rozšířila a stala se jedním z důležitých biochemických léků.

Syntéza

 

V současnosti jsou komerčně dostupné rekombinantní přípravky aprotinu převážně extrakty z orgánů, jako jsou hovězí plíce, které mají složité procesy a vysoké náklady. Proto je velmi důležité prozkoumat produkci rekombinantního aprotinu pomocí metod genetického inženýrství.

Při použití sekrečního expresního systému je produkce aprotinu obecně nízká a aktivita výsledného produktu je také nízká. Očekává se, že prostřednictvím fúzní exprese výrazně zvýší úroveň exprese rekombinantního aprotinu.

 

Pro tento účel byl zkonstruován rekombinantní expresní plazmid aprotinu pGrxA BPTI a mezi fúzním partnerem a rekombinantním aprotinem bylo navrženo rozpoznávací místo pro FXa. Po expresi ve formě inkluzního tělíska byl fúzní partner purifikován a znovu sbalen gelovou filtrací. Fúzní partner byl vyříznut pomocí FXa, aby se získal protein se stejnou aktivitou jako přírodní produkt. Prostřednictvím optimalizace expresních podmínek byl výtěžek významně zlepšen ve srovnání s předchozími expresními systémy.

Optimalizace exprese inženýrských bakterií:

 

Bakterie z glycerolové zkumavky naočkujte na LB/AMP agarové plotny, kultivujte při 37 stupních po dobu 20 hodin, seškrábněte kolonie a naočkujte je do 5 ml kapalného média LB/AMP při 37 stupních, 200 ot./min. a kultivujte přes noc. Naočkujte 5 % inokula do 100 ml média kukuřičné kaše, kultivujte při 37 stupních a 220 ot./min na třepačce, indukujte 7 hodin a poté odstřeďte (8000 ot./min., 5 minut, 4 stupně), abyste shromáždili bakteriální buňky. Zvažte vlhkou hmotnost bakteriálních buněk a detekujte jejich expresi pomocí 15% SDS-PAGE.

Kultivace ve fermentačních nádržích

 

Pěstování ve fermentační nádrži:

Použití německé fermentační nádrže Biostat 30 l, při 37 stupních, s rozpuštěným kyslíkem kontrolovaným na 20 %, pH 7,0. Použitím fermentačního tanku pro expresi fúzního proteinu bylo získáno 260 g vlhkých bakteriálních buněk ze 16 1 fermentačního bujónu, přibližně 16 g/l; Úroveň exprese je asi 45 %,

Rozbití stěny a získání bakteriálních buněk v inkluzním tělísku:

 

Po dokončení kultivace odeberte bakteriální buňky, přidejte 1 g bakteriálních buněk do 10 ml roztoku A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), důkladně je suspendujte, sonikujte buňky v ledové lázni, pracujte 30 sekund, interval 10 sekund, výkon 400 W, 30 cyklů. Přeneste kapalinu do centrifugační zkumavky, centrifugujte při 4 stupních a 8000 ot./min po dobu 15 minut a sraženina je surové inkluzní tělísko.

Příprava roztoku pro rozpouštění inkluzních tělísek:

 

Promyjte surové inkluzní tělísko roztokem B (50 mmol/l Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/l EDTA, 1% Triton-X100) dvakrát, pokaždé po dobu 0,5 hodiny, centrifugujte, abyste odstranili supernatant, a získejte relativně čistá inkluzní tělíska. Přidejte 1 g inkluzních tělísek k 5 ml roztoku C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L močoviny, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), inkubujte přes noc při 4 stupních, denaturujte a rozpusťte, centrifugujte při 12 000 ot./min. pro získání supernatantu v roztoku a shromážděte roztok supernatantu. Získejte rekombinantní aprotinn.

Farmakologické účinky:

 

 

Aprotinininhibuje lidský trypsin, fibrinolytický enzym, plazmatický a tkáňový angiotensin prostřednictvím reverzibilních komplexů inhibitorů enzymů vytvořených v určitém chemickém poměru. Proteázy se serinovou aktivitou hrají hlavní roli ve vazopresinovém kininogen kininovém systému, komplementovém systému a koagulačním systému, kde hrají kritickou roli plasmin a plazmatický vazopresin.

 

Aprotinn uplatňuje svůj inhibiční účinek tvorbou komplexu aprotinn proteázy prostřednictvím serinové aktivní části enzymu. Když je však kombinován s různými proteázami, vykazuje různé disociační konstanty. Vazba s trypsinem je nejsilnější (Ki=0.06nmoN), což je jedna z nejnižších konstant uváděná v proteinových -proteinových interakcích (Laydunski et al{4}}). Vazba na lidský fibrinolytický enzym není příliš silná. Vzhledem k vysoké hodnotě K komplexu enzymového inhibitoru (Ki=1 nmoN) může být reverzibilní (Wimann, 1980) a komplex, který se váže na angiotensin v lidské plazmě, je poměrně slabý (Ki=30 nmol/l), ale stále v terapeutickém rozmezí aprotinu (Nakahara, 1983).

 

Aprotinn se váže nejen na volné molekuly enzymu, ale i na enzymy, které se již navázaly na třetí složku (pokud má aktivní centrum enzymu ještě vazebnou schopnost). Proto aprotinn inhibuje volné fibrinolytické enzymy a může také inhibovat intermediární fibrinolysinový řetěz kinázový komplex vytvořený během trombolytické terapie řetězcovou kinázou (Wimann, 1980).
Antifibrinolytický účinek aprotinu je založen na inhibici plasminu aktivovaného hydrolýzou bílkovin. Na rozdíl od syntetických antifibrinolytických rozpouštědel díky své přímé inhibici nadměrně aktivovaného plasminu aprotinn nejen chrání přímý substrát (fibrin) před degradací plasminem, ale také chrání fibrinogen, faktory V a VIII v plazmě a alfa 2-globulin v séru.

 

V experimentech endotoxinem indukovaného šoku a hypovolemického šoku může Trasylol významně inhibovat aktivaci kininogenu. (Massion et al., 1972).
Trasylol může zabránit nebo oddálit rozvoj plicního intersticiálního edému (šok z plic). Jeho inhibiční účinek je -závislý na dávce a{2}} času (Lorthioir et al., 1973).
Během šoku může ischemická slinivka produkovat vysoce toxickou peptidovou látku, konkrétně myokardiální inhibiční faktor (MDF). Tento faktor úzce souvisí se smrtí šokem.

 

MDF lze detekovat v plazmě myší, psů, opic a lidí s hemoragickým, septickým, kardiogenním šokem a popáleninovým šokem. MDF může způsobit snížení kontraktility myokardu ve všech případech krvácení a současně způsobí kontrakci viscerálních odporových cév, což vede k lokální ischemii a produkci většího množství MDF. Navíc v důsledku toxického poškození retikuloendoteliálního systému je jeho clearance v krevním řečišti zpožděna. Trasylol může výrazně zabránit produkci MDF (Lefer 1984).

Aprotininjako sloučenina s malou molekulou, která odolává fibrinolýze, vykazuje významné a specifické enzymové inhibiční vlastnosti. Nejen, že účinně inhibuje aktivitu trypsinu, ale také značně působí na další příbuzné proteolytické enzymy, čímž hraje důležitou roli v experimentech buněčné biologie. Zejména během buněčné a tkáňové lýzy a homogenizace může Aprotinn sloužit jako účinný inhibitor proteázy, který účinně brání náhodné degradaci cílových proteinů, což je klíčové pro zachování integrity a přesnosti vzorku.

Inhibiční účinek Aprotinnu vykazuje jasnou závislost na dávce, to znamená, že jak se jeho koncentrace zvyšuje, odpovídajícím způsobem se zvyšuje i inhibiční účinek na fibrinolytickou aktivitu. Tato funkce umožňuje výzkumníkům přesněji řídit experimentální podmínky, aby získali spolehlivější a reprodukovatelnější experimentální výsledky. Mezitím může Aprotinn také prodloužit dobu srážení krve, což dále potvrzuje jeho důležitou roli v mechanismu koagulace. Experimenty in vitro ukázaly, že Aprotinn je účinným inhibitorem endogenní koagulační cesty, který může interferovat s klíčovými procesy v procesu koagulace a regulovat je.

Aprotini také prokázal své jedinečné farmakologické účinky. Může významně inhibovat proces rozpouštění krevní sraženiny in vitro, prodloužit dobu krvácení při ořezávání ocasu u potkanů ​​a prodloužit dobu koagulace v lidské plazmě. Tato zjištění naznačují, že Aprotinn může mít potenciální protikrvácející a antitrombotické účinky. K dalšímu ověření jeho účinku in vivo vědci provedli experimenty na modelu arteriovenózního zkratu u potkanů. Výsledky ukázaly, že Aprotnin může významně snížit hmotnost krevních sraženin, což dále podporuje jeho potenciál jako antitrombotického léku.

Stručně řečeno, Aprotnin, jako sloučenina s malou molekulou, která inhibuje fibrinolýzu, prokázal významné inhibiční vlastnosti enzymů a farmakologické účinky jak in vitro, tak in vivo. Jeho aplikace v experimentech buněčné biologie poskytuje výzkumníkům výkonné nástroje, zatímco jeho zjištění ve studiích in vivo poskytují důležitá vodítka a základ pro jeho vývoj jako léku proti krvácení a trombotiku. V budoucnu, s dalším výzkumem mechanismu účinku Aprotninu a klinickými studiemi, se očekává jeho širší uplatnění v lékařské oblasti.

Populární Tagy: aprotinin cas 9087-70-1, dodavatelé, výrobci, továrna, velkoobchod, koupit, cena, hromadné, na prodej